为什么需要切胶回收？
DNA 凝胶电泳后，需要从凝胶中回收特定片段进行后续实验：
克隆转化
测序分析
探针制备
文库构建
方法概述
方法原理回收率纯度适用片段柱式法硅胶柱吸附60-80%高100bp-10kb凝胶熔解法低熔点琼脂糖70-90%中<1kb电泳洗脱法电泳收集80-95%高各种大小传统酚抽提有机溶剂50-70%中>500bp
柱式回收法（最常用）
试剂盒组成
平衡液 BL
溶胶液 PNP（或 Buffer）
洗涤液 PW
洗脱液 EB
硅胶柱和收集管
操作步骤
1. 切胶
↓ 在紫外灯下切取目标条带
2. 称重
↓ 记录凝胶重量（1mg ≈ 1μL）
3. 溶胶
↓ 加入等体积溶胶液，55°C 加热 5-10 分钟
4. 上柱
↓ 溶液转移到柱子中，离心 1 分钟
5. 洗涤
↓ 加入 PW 洗涤，离心，重复一次
6. 晾干
↓ 室温放置 2-5 分钟挥发残留乙醇
7. 洗脱
↓ 加入 EB 或水，离心收集 DNA
关键技巧
切胶操作：
紫外灯强度适中，避免 DNA 损伤
尽量切除多余凝胶，减少杂质
动作迅速，减少紫外照射时间
切块尽量小，提高回收率
溶胶步骤：
确保凝胶完全溶解
如体积过大，可分批处理
溶胶时可间歇摇晃加速溶解
洗涤步骤：
确保无残留乙醇
可延长离心时间确保干燥
避免触碰柱子膜
洗脱步骤：
预热洗脱液可提高回收率
静置 2 分钟再离心
第二次洗脱可提高回收量
低熔点胶回收法
适用于后续酶反应（克隆、酶切等）
操作流程
使用低熔点琼脂糖（LM agarose）制胶
电泳分离 DNA 条带
在可见光下切取条带（避免紫外损伤）
70°C 水浴融化凝胶（约 5 分钟）
加入 3 倍体积的 TE Buffer
45°C 温浴 5 分钟
酚抽提去除琼脂糖
乙醇沉淀回收 DNA
注意事项
低熔点琼脂糖纯度更高
切割时用可见光观察
后续酶反应需去除残留琼脂糖
回收产物质量评估
检测方法
方法目的凝胶电泳确认条带大小和纯度微量分光光度计测定浓度和纯度酶切验证确认酶切位点完整测序确认序列正确
质量标准
浓度：通常 10-100 ng/μL
纯度：OD260/280 = 1.8-2.0
完整性：电泳显示单一清晰条带
回收量：根据起始量和片段大小估算
常见问题
问题可能原因解决方案回收量低凝胶溶解不彻底延长溶胶时间洗脱不充分预热洗脱液，二次洗脱DNA 已降解减少紫外照射时间纯度低凝胶未切干净尽量切除多余凝胶乙醇残留延长晾干时间条带位置偏移酶切不完全优化酶切条件克隆失败末端损伤减少紫外照射，使用蓝光
保存建议
形式保存条件时间DNA 溶液-20°C TE Buffer1-2 年干燥 DNA-20°C长期克隆质粒-80°C 甘油菌长期
最佳实践
减少紫外损伤：使用低强度紫外灯，尽快完成切割
选择合适方法：根据片段大小和后续实验选择回收方法
控制切胶量：过多凝胶降低回收率和纯度
验证回收产物：电泳确认后再进行后续实验
记录详细信息：记录回收日期、片段大小、浓度等信息
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